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《中国武汉爆发新型冠状病毒核心要点及基于表位的疫苗设计》

  • 来源专题：新发突发疾病（新型冠状病毒肺炎）
  • 编译者： 蒋君
  • 发布时间：2020-02-25

  • 武汉新型冠状病毒（2019-nCoV）暴发已出现全球大流行，引起科学界的广泛关注。至今，尚未出现可有效抵抗病毒感染的疗法或疫苗。这项研究使用反向疫苗学和免疫信息学方法，目的希望设计出针对表位的亚单位疫苗。经过不断的计算实验，共设计了三种可能的疫苗构建体。依据分子对接研究，选择了其中一种最佳的疫苗构建物。随后，分别开展分子动力学模拟和密码子适应实验以明确其生物学稳定性，并期望找到疫苗有效批量生产策略。

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相关报告

  • 《应对疫情爆发的新型疫苗技术概述》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：huangcui
    • 发布时间：2018-12-21
    • 自200多年前第一种疫苗被研制出以来，疫苗接种极大地减轻了世界范围内传染病的负担，其中最显著的效果便是根除了天花，并且控制了脊髓灰质炎、破伤风、白喉和麻疹等疾病。目前大量的研究工作集中在改进现有的疫苗和发现新的疫苗上，比如2006年开发的人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。然而，全球人口密度、年龄分布和旅行习惯的巨变以及气候的改变都有助于新旧病原体的出现，这些病原体的存在成为疾病大流行威胁的风险。近年来，艾滋病毒（HIV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、埃博拉病毒和寨卡等严重感染性疾病的迅速蔓延，突显出了全世界对做好疾病大流行万全准备的迫切需求，需要快速地研发和配备相应的疫苗以应对那些可能新出现的病原体。更重要的是，还要寻找新的方法来应对抗生素耐药细菌的感染。考虑到以上种种，现有的用于确定新候选疫苗的方法已经不足以保障全球了。因此，开发能够实现快速开发和大规模生产的新疫苗技术至关重要。 9月19日，Frontiers in Immunology期刊发表文章《应对疫情爆发的新型疫苗技术》（New Vaccine Technologies to Combat Outbreak Situations），集中讨论了应对这些全球卫生威胁挑战的潜在新方法，包括病毒载体疫苗以及核酸（DNA和mRNA）疫苗等。 在疾病爆发情况下疫苗研发面临的挑战 传统的常规疫苗通过减毒或灭活相应病原体的方法，成功地减轻了相关传染病的传播，包括促使天花的消灭以及对脊髓灰质炎、破伤风、白喉和麻疹等疾病的控制。然而，现有的疫苗制备方法在疫情爆发的情况下可能并不合适甚至不可行。减毒活疫苗通常都有逆转的风险，这使得该方法不适于针对高致病性并且未经鉴定的病原体疫苗的开发。而灭活的疫苗可能无法激活人体的免疫反应（如埃博拉疫苗），甚至还可能导致不良反应的发生，比如在20世纪60年代的临床试验中，经福尔马林灭活的呼吸道合胞病毒（RSV）会在野生型RSV感染中加剧疾病。此外，疾病爆发的具体情况也可能限制常规疫苗开发的可生产性。常规的方法要求对病原体的培养和繁殖，而在疫苗生产的过程中，可能会受到各个因素的阻碍，比如在体外条件下难以或无法培养出病原体，或者对病原体的培养需要在较高生物安全等级和专门的实验室中进行。因此，需要新的普适方法来对完整病原体经行培养，有效并快速地对抗疫情的发生。 要验证这些新技术能否对于未来的疾病大流行起着有效预防作用，还需要克服很多挑战。新发病原体的不可预测特性是全球疾病大流行防范的核心问题之一。人畜共患病不断对人类造成威胁，如艾滋病毒、SARS病毒和中东呼吸综合征冠状病毒这类以前没有被鉴定过的病原体被引入人群中。而流行性流感病毒引起的全球爆发表明，已知的病原体也有变异和适应新宿主或新环境的潜力。近年来的局部地区疫情和全球范围内疫情充分说明，RNA病毒引发疫情的风险最高，其高突变率有利于其的适应性。 由于在疫情爆发前无法确定相关病原体，时间跨度仍然是开发有效疫苗所面对的主要障碍之一。目前，传统疫苗在临床阶段的平均开发时间基本都在10年以上。因此，迫切需要新的方法，快速开发疫苗和进行使用许可，以防止新爆发的疫情蔓延全球。 另一个主要的问题是疫苗开发生产的成本。使用现有的技术手段开发一种新的候选疫苗估计需要超过5亿美元，而进一步建立设施和设备的费用则从5千万美元到7亿美元不等。虽然说为了达到安全标准，某些疫苗开发的成本是无法避免的，但是在大多数传统疫苗技术中，对每种疫苗的专门生产过程和设施的需求使得疫苗的功能验证及生产成本居高不下。 另一个问题是现有方法的生产力通常不足以供应全球疫苗接种。即便已经知道潜在的威胁，并且已经建立了疫苗生产的技术流程，比方说对流感疫苗的制备，在流感爆发的高峰期间，疫苗的供应还是存在问题。经过世界卫生组织（WHO）的努力，流感疫苗在2015年时的潜在生产能力理论上说可以供应全球43%的人口接种两剂疫苗。然而疫苗生产的全球分销在发达国家和发展中国家之间存在巨大的差异：2015年一项研究调查显示，仅5%的流感疫苗剂量分布在东南亚、地中海东部和WHO非洲区域，而这些地方有着全球一半的人口。此外，大多数目前获批的流感疫苗鉴定病毒基因型和生产分发的过程要经历3-5个月的时间，这已经足够让流感病毒在全世界范围内传播了。因此，面对疫情爆发的威胁，快速生产大量疫苗的技术是非常必要的。 目前通过监测具有高流行潜力的病毒来应对这些挑战的机构中，最值得注意的是流行病防范创新联盟（Coalition for Epidemic Preparedness Innovations，CEPI），它主要资助和开发针对潜在大流行病原体的疫苗。 疫苗技术 过去几十年间，一系列新疫苗技术发展蓬勃，从活病原体的靶向衰减技术到生物工程蛋白和抗原肽以及病毒载体和核酸抗原技术层出不穷。该文章重点讨论病毒载体及核酸疫苗。 病毒载体疫苗 基于病毒载体的疫苗需要在一个不相关的，经过人工修改的病毒中插入一个或多个抗原的编码基因，这是一个高度通用的平台。相比于目前许多成熟的疫苗技术，这种方法存在许多优势。这种技术通常采用有活性的（能复制但很微弱）或非复制型的载体。20世纪80年代以来，大量的研究已经构建了多种病毒作为疫苗载体，这些病毒进入宿主细胞后能够编码外源的抗原。 鉴于目前已经有大量不同类型的病毒载体可供选择，并且它们作为免疫原的使用操作和相关功能都有海量的研究，这种病毒载体疫苗是疫苗开发方面一个很有价值并且具有高度通用性的研发平台。 病毒基因组在经过改造后可以表达任何一种抗原蛋白，它们这种稳定接受基因组中插入较大基因片段的能力是对疫苗大量开发一个强有力支持。在用基因信息传递目的抗原的过程中，需高保真的抗原合成，准确定位和加工，比方说蛋白质的折叠、多聚、修饰以及保证其在细胞内被运输到特定的靶点。值得注意的是，这种方法一般适用于人类病原体来源的病毒靶向抗原，它们会在人类细胞中自然表达。而那些细菌抗原或寄生虫抗原有可能在哺乳动物细胞中有着不一样的定位和加工方式。病毒载体能够在模拟自然感染的靶细胞中诱导刺激，从而激活有效的免疫反应。因此，病毒载体疫苗无需额外的佐剂即可接种。 虽然病毒载体疫苗有许多优点，但是疫苗开发时还必须考虑几个方面。首先，病毒载体是转基因的产物，因此有人认为它们的释放会对人类健康和环境造成潜在的威胁。其次，病毒载体疫苗的使用引发了对其在人体中安全性问题的关注，比如说这些病毒是否会整合到宿主基因中或者说减毒的疫苗在宿主细胞内是否会持续大量复制。这些问题都要在疫苗开发前和进行临床试验期间做好详细的评估。因为这些担忧不仅关乎疫苗安全，还很有可能在疾病大流行情况下导致临床研究的推迟。 在病毒载体疫苗的生产过程中，每个病毒系统都需要用不同的细胞体系进行培养，因此不同的病毒载体需要不同的制造设备。病毒载体疫苗的生产是一个相当复杂的过程，通常会涉及到多种来自人类或动物的成分，因此在疫苗生产的各个步骤中都需要对污染物进行全面检测。 DNA疫苗 核酸疫苗的开发和生产有许多优势，然而使用DNA作为疫苗的基础也有劣势。其中一个问题是注射这种疫苗后DNA质粒在体内是否会长期存在。事实上，很多临床前研究表明，在小鼠模型里，肌肉注射DNA疫苗后，该DNA质粒可在体内存在达两年之久，并且能检测到其低水平的表达和免疫原性。尽管在一些实验中并没有检测到小型动物模型肌肉注射后出现DNA整合的现象，但是在经过小鼠电转实验后能够观察到基因组整合的现象。这表明了整合现象虽然是小概率事件，但是仍要在增加外源DNA摄取的体系中考虑到这一风险。 WHO建议将整合研究作为DNA疫苗临床前安全计划的一部分。此外，还要考虑注射含有非甲基化CpG序列的细菌DNA是否也会引发安全问题。在接种过疫苗的生物体内，抗药性的标记是否存在潜在表达能力这一疑问同样也引起了疫苗安全方面的担忧，研究人员会在新一代DNA疫苗中选用替代的筛选标记来消除这一疑虑。 最后一点，那些用来增强DNA疫苗免疫原性的细胞因子或共刺激因子的加入，可能会对身体内细胞因子的正常表达和释放产生不良影响，比如说造成广泛的免疫抑制、慢性炎症反应或自身免疫疾病。 RNA疫苗 尽管已有研究报道经皮内或淋巴结内途径注射裸露mRNA能够诱导免疫应答，但只有mRNA还不足以用作广泛使用的预防性疫苗。由于细胞外普遍存在核糖核酸酶可以催化RNA的水解，处于非保护状态下的裸露mRNA在生理条件下是高度不稳定的，并且由于其亲水性和强大的净负电荷性，进入体内后很难被细胞有效地吸收。而克服了这一系列问题的新一代mRNA利用了脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle，LNP）一类的高效载体，使mRNA不受核糖核酸酶的影响，延长相应的抗原在体内表达的时间，因而在该疫苗进行体内注射后能够产生强有力的体液免疫反应和细胞免疫反应。 利用RNA疫苗激活天然免疫反应可能是一把双刃剑。系统性的I型干扰素对模式识别受体的激活有促进免疫应答的作用，但是它也会导致真核细胞内翻译起始因子2α的磷酸化，从而导致蛋白质翻译缓慢甚至是被抑制。目前已经有很多研究旨在克服I型干扰素通路激活所导致蛋白质翻译停滞以及mRNA降解的增加。然而目前尚不确定哪种方法会为人类预防疫苗提供更好的基础。 与DNA疫苗一样，mRNA疫苗能够诱导机体的体液免疫和细胞免疫反应。mRNA疫苗体积非常小，只包含了一个选定抗原的开放阅读区域（open reading frame，ORF）并辅以特定的调控元件，因此它们不会像病毒载体疫苗那样诱发机体对疫苗载体的免疫，因此可以进行多次注射。此外，mRNA疫苗可以通过不同的途径使用传统的注射方法（DNA疫苗的注射还需辅以基因枪等设备）。因此，mRNA疫苗为大众提供了一个灵、快速、最具成本效益的选择方案。 总结 艾滋病、埃博拉病毒及寨卡病毒的流行引起了全世界对威胁人类健康的病原体的防范与关注。新发病原体的出现可以促进疫苗研发平台的发展以应对未来疫情的爆发，为预防工作提供动力。新的疫苗研发平台，比如说病毒载体疫苗和核酸疫苗都有其自身的优缺点，这与它们诱导特定免疫反应的能力、生产能力和安全性都有关系。 病毒载体疫苗能够诱导机体对其携带的特定靶抗原产生有效的免疫应答。事实上，许多临床试验已经证明，病毒载体疫苗，比如说VSV-ZEBOV在诱导人类产生保护性反应方面有很大的前景。然而，在非相关病毒环境下进行抗原传递使得这项技术在生产制造方面稍显复杂。DNA疫苗的生产拥有相对简单、完全合成的优势，虽然在DNA载体中存在的非功能性序列引起了监管安全方面的担忧，但是新的DNA疫苗技术已经允许DNA载体只携带目标抗原的核酸序列。 与DNA疫苗一样，RNA疫苗技术支持相对简单，完全合成的制造工艺，可以使用相同的生产工艺和设备制造不同的RNA疫苗。不仅如此，在疫苗安全性方面，RNA疫苗缺乏在基因组中整合的能力，并且也不会如DNA疫苗一样的体内持续存在，这是其一大优势。可是，由于RNA疫苗是上述介绍中最新的一项技术，因此它在人类中的使用还不如前两者突出。幸运的是，迄今为止的临床研究在安全性和免疫原性方面都取得了令人鼓舞的结果，并且为进一步的临床探索提供了强有力的支持。
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  • 《COVID-19冠状病毒流行是自然原因》
    • 来源专题：生物安全网络监测与评估
    • 编译者：yanyf@mail.las.ac.cn
    • 发布时间：2020-03-24
    • 根据发表的发现，去年在中国武汉市出现的新型SARS-CoV-2冠状病毒是自然进化的产物，自那以后引起了大规模的COVID-19流行并传播到其他70多个国家。今天在《自然医学》杂志上发表 对来自SARS-CoV-2和相关病毒的公共基因组序列数据的分析发现，没有证据表明该病毒是在实验室中制造或以其他方式设计的。 “通过比较已知冠状病毒株的可用基因组序列数据，我们可以坚定地确定SARS-CoV-2来自自然过程，” Scripps Research免疫学和微生物学副教授Kristian Andersen博士说。纸。 除了Andersen之外，图兰大学的Robert F. Garry以及《 SARS-CoV-2的近端起源》一书的作者。悉尼大学的爱德华·霍姆斯（Edward Holmes）；爱丁堡大学的Andrew Rambaut；哥伦比亚大学的W. Ian Lipkin。 冠状病毒是一大类病毒，可导致严重程度范围广泛的疾病。冠状病毒引起的第一个已知的严重疾病是2003年在中国爆发的严重急性呼吸系统综合症（SARS）。 2012年，沙特阿拉伯爆发了第二次严重疾病，爆发了中东呼吸综合症（MERS）。 去年12月31日，中国当局向世界卫生组织发出警告，称新的冠状病毒毒株暴发引起严重疾病，该毒株后来被命名为SARS-CoV-2。截至2020年2月20日，已记录了近167,500例COVID-19病例，尽管还有更多轻度病例可能未被诊断。该病毒已杀死6600多人。 流行病开始后不久，中国科学家对SARS-CoV-2的基因组进行了测序，并将数据提供给全世界的研究人员。所得的基因组序列数据表明，中国当局迅速发现了该流行病，并且由于单次引入人群后人与人之间的传播，COVID-19病例的数量一直在增加。其他几个研究机构的Andersen和合作者使用此测序数据，通过重点研究该病毒的几种典型特征来探索SARS-CoV-2的起源和进化。 科学家分析了刺突蛋白的遗传模板，刺突蛋白是病毒外部的骨架，用来捕获并穿透人和动物细胞的外壁。更具体地说，他们集中研究了刺突蛋白的两个重要特征：受体结合域（RBD）（一种钩住宿主细胞的钩子）和裂解位点（一种分子开罐器），它可以使病毒裂解然后输入宿主细胞 自然进化的证据 科学家发现，SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD部分已经进化为有效靶向人细胞外部称为ACE2的分子特征，ACE2是参与调节血压的受体。实际上，SARS-CoV-2刺突蛋白在结合人类细胞方面是如此有效，以至于科学家得出结论认为，它是自然选择的结果，而不是基因工程的产物。 SARS-CoV-2骨架的数据-整体分子结构支持了自然进化的证据。如果有人试图设计一种新的冠状病毒作为病原体，那么他们将利用已知会引起疾病的病毒的骨干来构建它。但是科学家发现，SARS-CoV-2主链与已知的冠状病毒有很大的不同，并且大多数类似于蝙蝠和穿山甲中发现的相关病毒。 安德森说：“病毒的这两个特征，即刺突蛋白的RBD部分的突变及其独特的骨架，排除了实验室操纵作为SARS-CoV-2的潜在来源的可能性。” 英国Wellcome Trust流行病学负责人Josie Golding博士说，Andersen及其同事的发现“对于为流传有关病毒起源（SARS-CoV）的谣言提供基于证据的观点至关重要。 -2）导致COVID-19。” Goulding补充说：“他们得出结论，该病毒是自然进化的产物，结束了对故意基因工程的任何猜测。” 病毒的可能来源 根据他们的基因组测序分析，Andersen及其合作者得出结论，SARS-CoV-2的最可能起源遵循两种可能的情况之一。 在一种情况下，该病毒通过在非人类宿主中的自然选择演变为当前的致病状态，然后跳向人类。这就是以前的冠状病毒爆发的方式，人类直接暴露于麝香（SARS）和骆驼（MERS）后感染了该病毒。研究人员提出，蝙蝠是SARS-CoV-2最可能的储存库，因为它与蝙蝠冠状病毒非常相似。然而，尚无蝙蝠直接传播的案例，这表明蝙蝠与人类之间可能存在中间宿主。 在这种情况下，SARS-CoV-2刺突蛋白的两个显着特征-与细胞结合的RBD部分和打开病毒的切割位点-在进入人类之前已经进化到它们的当前状态。在这种情况下，一旦感染人类，当前的流行病可能会迅速出现，因为该病毒已经进化出使其具有致病性并能够在人与人之间传播的特征。 在另一种建议的方案中，该病毒的非致病性版本从动物宿主跃入人类，然后在人群中演变为目前的致病状态。例如，一些来自穿山甲，在亚洲和非洲发现的犰狳类哺乳动物的冠状病毒的RBD结构与SARS-CoV-2非常相似。来自穿山甲的冠状病毒可能已经直接或通过中介宿主（如麝猫或雪貂）传播给了人类。 然后，SARS-CoV-2的另一个独特的刺突蛋白特征性切割位点可能已经在人类宿主内进化，可能是通过在流行病开始之前人类人群中未被检测到的有限循环。研究人员发现，SARS-CoV-2裂解位点看起来与禽流感菌株的裂解位点相似，该株已证明可以在人与人之间轻易传播。 SARS-CoV-2可能已经在人类细胞中进化出了这种强力裂解位点，并很快开始了当前的流行病，因为冠状病毒可能已经变得更有能力在人与人之间传播。 该研究的合著者安德鲁·兰巴特（Andrew Rambaut）警告说，目前很难甚至不可能知道哪种情况最有可能发生。如果SARS-CoV-2以当前的病原体形式从动物源进入人类，则会增加未来爆发的可能性，因为致病病毒株仍可能在动物种群中传播，并可能再次跳入人类。非致病性冠状病毒进入人群，然后发展出类似于SARS-CoV-2的特性的机会更低。 该研究的资金由美国国立卫生研究院，皮尤慈善基金会，惠康基金会，欧洲研究委员会和ARC澳大利亚获奖者奖学金提供。
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