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《Genome Biology | 升级版RNA编辑技术：可以在灵长类非人灵长动物中实现有效的RNA编辑》

  • 来源专题：战略生物资源
  • 编译者： 李康音
  • 发布时间：2023-12-04

  • 本文内容转载自“生命科学前沿”微信公众号。原文链接: https://mp.weixin.qq.com/s/f54OJVDV9vQPHFk42t5YHg

    2023年10月23日，北京大学魏文胜和博雅基因袁鹏飞共同通讯在Genome Biology 在线发表题为Utilizing AAV-mediated LEAPER 2.0 for programmable RNA editing in non-human primates and nonsense mutation correction in humanized Hurler syndrome mice的研究论文，该研究展示了通过AAV介导的环状ADAR招募的RNA（arRNAs）递送在适用于治疗的剂量下，可以在灵长类非人灵长动物中实现有效的RNA编辑。

    在感染后的4至13周内，AAV感染的细胞中的编辑效率可以达到约80％，即使在高剂量下也没有明显的毒性。此外，当AAV传递的循环arRNAs被系统地用于Hurler综合症人源化小鼠模型时，它能够精确纠正早期终止密码子，并在多个器官中恢复由Hurler致病基因编码的IDUA酶的功能。

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  • 《如何使基因编辑工具CRISPR工作得更好》
    • 来源专题：转基因生物新品种培育
    • 编译者：zhangyi8606
    • 发布时间：2018-11-09
    • 近年来最重大的科学进展之一是发现和发展了利用一种称为CRISPR的快速且负担得起的技术对生物进行基因改造的新方法。现在，德克萨斯大学奥斯汀分校的科学家们说，他们已经发现了一种容易升级的技术，这种技术可以导致更精确的基因编辑，并提高安全性，从而为基因编辑用于人类打开足够安全的大门。 分子生物学家小组发现了确凿的证据，目前在CRISPR基因编辑中使用的最流行的酶，也是第一个被发现的酶Cas9，它比使用较少的CRISPR蛋白（称为Cas12a）具有更低的有效性和精确性。 因为Cas9更可能编辑植物或动物基因组的错误部分，破坏健康功能，所以科学家在8月2日发表在《分子细胞》杂志上的研究报告中提出，转用Cas12a将导致更安全和更有效的基因编辑。 “总体目标是找到自然界给我们的最好的酶，然后使它变得更好，而不是采用第一个通过历史偶然发现的酶，”分子生物科学的助理教授和这项研究的合著者Ilya Finkelstein说。 科学家们已经开始使用CRISPR，这是一种细菌用来抵御病毒的自然机制，来更多地了解人类基因，转基因植物和动物，并发展这种由科幻小说激发的进步，如含有抗脂肪小鼠基因的猪能导致瘦培根。许多人期待CRISPR能够为人类疾病提供新的治疗方法，并作物拥有更高产量或抵抗干旱、害虫。 但是，在自然界发现的CRISPR系统有时会瞄准基因组中的错误位点，这应用于人类可能是灾难性的，例如，未能纠正遗传疾病，而是将健康细胞转化为癌细胞。 以往的研究表明Cas12a比Cas9好，但以前的研究尚不明确。这项最新研究中，研究人员说，通过显示出Cas12a是比Cas9更精确的基因编辑刀结束了案例，并解释原因。 该研究小组由研究生Isabel Strohkendl和Rick Russell带领，发现Cas12a的选择性更强，因为它像维可牢一样与基因组靶结合，而Cas9更像超级胶一样与靶结合。每种酶都携带一串用RNA编写的基因代码，与病毒DNA中写入的一串目标基因代码相匹配。当它碰到一些DNA时，酶开始试图通过形成碱基对来与它结合——从一端开始，然后沿着它的方向工作，测试一侧的每个字母（DNA）与另一侧相邻的字母（RNA）匹配得如何。 对于Cas9，每个碱基对紧密地粘合在一起，就像一块超级胶水。如果每边的前几个字母匹配得很好，那么Cas9已经与DNA强结合了。换言之，Cas9关注基因组目标中的前七或八个字母，但是随着这个过程的继续就关注较少，这意味着它很容易忽略稍后在过程中的失配，这将导致它编辑基因组的错误部分。 对于Cas12a来说，它更像是一个尼龙搭扣。在沿途的每一点联系相对较弱。沿着带子的两边是一个很好的匹配，保持足够长度进行编辑使其联接到一起。这使得它更可能只编辑基因组的预期部分。 “它使碱基对的形成过程更加可逆，”Russell说。“换句话说，Cas12a在继续之前对检查碱基对做得更好。在七或八个字母之后，Cas9停止检查，而Cas12a继续检查到大约18个字母。” 研究人员说，Cas12a还不是完美的，但是研究还建议了进一步改善Cas12a的方法，也许有一天实现创造“精密手术刀”的梦想，一种本质上防错的基因编辑工具。 Finkelstein说：“总体来说Cas12a更好，但是有些地方Cas12a仍然对RNA和基因组靶标之间的某些错配有令人惊讶的盲目。”“因此，我们的工作为进一步改进Cas12a指明了一条清晰的道路。” 研究人员目前将这些见解用于设计改进Cas12a的后续项目。 该研究的其他合作者是研究生James Rybarski和前本科生Fatema Saifuddin。 这项工作得到了国立普通医学科学研究所和韦尔奇基金会的资助。
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  • 《Cell综述 | CRISPR基因组编辑技术的过去、现在和未来》
    • 来源专题：战略生物资源
    • 编译者：李康音
    • 发布时间：2024-03-13
    • 2024年2月29日，苏黎世大学的研究人员在 Cell 期刊发表了题为Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies的综述论文。在这篇综述中，作者讨论了CRISPR基因编辑技术在研究和治疗方面的现状，强调了限制它们的局限性和近年来开发的技术创新来解决这些问题。此外，还检查和总结了基因编辑在人类健康和治疗方面的当前应用情况。最后概述了未来可能影响基因编辑技术及其应用的潜在发展。 基因组编辑，即对生物体遗传物质进行精确和有针对性的修改，是分子生物学领域最重大的进展之一。它具有深远的应用，从揭示基本的生物学过程到推动医学、农业和生物技术的发展。随着2023年底首次批准基于CRISPR疗法用于人类疾病治疗，CRISPR基因组编辑正在进入一个新时代。该综述旨在提供CRISPR基因组编辑全景视角，强调其当前状态、潜在的未来发展以及必须克服的障碍，以充分实现其在人类医学中的承诺。 CRISPR-Cas核酸酶的可编程性使其能够产生位点特异性的DNA双链断裂，从而使其能够快速适应基因组编辑技术。来自化脓链球菌的典型Cas9蛋白（SpCas9）是第一个被用于基因组编辑的Cas核酸酶，由于其固有的高活性和特异性，目前仍然是最广泛使用的基因编辑器。Cas12a是一种起源于V型CRISPR-Cas系统的Cas核酸酶，在Cas9之后几年被发现，同样被用于基因组编辑。与Cas9不同，Cas12a不需要tracerRNA进行激活，这一特点已被用于体内多重编辑。 CRISPR-Cas系统作为简单有效的可编程基因编辑工具的重新应用，极大地推进了许多基础和应用研究领域，为开发靶向基因治疗和各种生物技术应用奠定了基础。然而，高度进化的生物防御系统的功能特征与精确的基因组编辑工具的功能有所不同。因此，第一代基于CRISPR的基因编辑工具的应用潜力受到几个关键因素的限制，主要包括特异性、靶向范围，以及依赖内源性DSB修复机制来实现基因组编辑，此外，CRISPR组分的递送受到递送载体和目标细胞或生物体的特定限制。 自基于CRISPR的基因编辑首次展示以来，该领域已经得到了前所未有的发展。基于Cas9和Cas12a核酸酶的第一代DNA双链断裂依赖性基因组编辑器的功能已经通过不断创新得到增强，这些创新不仅增加了这些工具的多功能性，还提高了它们的精度并最小化了非预期编辑后果。然而，对于它们安全性的担忧仍然存在，这既是因为脱靶编辑活性，也由于靶向DNA双链断裂的潜在基因毒性效应。为了减少非预期编辑的发生，已经探索了多种方法来精确地控制CRISPR基因组编辑器。 CRISPR基因组编辑技术的发展带来了一系列具有显著潜力的应用，从基础研究的进步到新治疗方法的开发。首先，CRISPR已经改变了遗传学研究，使科学家能够在各种实验模型中模拟致病突变，创建大规模的全基因组筛查方法，并开发合成基因记录设备来研究正常发育和疾病进展。CRISPR系统还被被用于开发分子诊断，使病毒DNA或RNA的检测变得特异、快速和灵敏。其次，CRISPR技术还被用于建立消除病毒或细菌人类病原体的策略，后者是通过开发工程噬菌体实现的。限制病原体传播的一个具体例子是基于CRISPR的基因驱动，其中引入特定的抑制性特征（例如雌性不育），以摧毁携带病原体的昆虫种群（主要是传播疟疾等疾病的蚊子）。最后，过去十年的CRISPR基因组编辑已经发展出多种治疗遗传病的方法，其中一些已经从基于细胞和动物模型的临床前研究进入了人类临床试验。这包括体内和体外治疗纠正策略。体内治疗纠正方法涉及将基因编辑组件输送到人体内部受影响的组织。相比之下，体外方法涉及从患者身上收集细胞，在实验室中编辑它们，然后将编辑后的细胞移植回患者体内。此外，体外CRISPR编辑还使自体和异体基因组修饰的细胞疗法的产生成为可能，主要用于癌症免疫治疗。 随着当前CRISPR技术的局限性在过去十年中变得越来越明显，新的方法和方法学不断发展和优化，以解决这些限制并提高基于CRISPR的基因组编辑的效率和多样性。这些新兴的第三代工具和技术，包括最近发现的紧凑型RNA引导核酸酶类，这些核酸酶已被用于基于DNA双链断裂的编辑，并可作为其他基因组编辑器（例如碱基编辑和先导编辑）的RNA引导的DNA结合平台。 在基因组编辑领域，向宿主基因组中插入大片篇的DNA序列，特别是在缺乏同源定向修复（HDR）的非分裂细胞中，仍然是一个主要的未满足需求。在这种背景下，CRISPR引导的重组酶和转座子的开发提供了一种有前途的和潜在强大的途径来填补这一技术缺口。基于逆转录转座子的基因组编辑技术和编辑RNA转录本的新方法也已经出现。最后，新的基因组编辑工具的创建继续与递送方法的发展相伴而行，这对治疗应用构成了重大挑战。 总的来说，这些进步反映了快速发展的基因组编辑领域的动态，其中每种新方法都提供了互补的优势，以解决基因操作的各种需求和挑战。 此外，对于DNA双链断裂的基因毒性以及同源定向修复（HDR）低效率的担忧进一步推动了“第二代”CRISPR技术的发展，这些技术在不依赖于DNA双链断裂形成和HDR的情况下介导基因组编辑，其中最具代表性的是碱基编辑器（base editor，BE）和先导编辑器（prime editor，PE）。目前可用的CRISPR基因组编辑技术主要包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、碱基编辑、先导编辑、转录调控、RNA编辑，这为基因组编辑提供了更具针对性的方法，特定技术特别适合某些类型的编辑或递送模式。但虽然这些基因组编辑工具包的新增内容对解决与规范化CRISPR基因组编辑相关的许多限制做出了显著贡献，但它们在编辑活性、特异性和递送方面仍然存在一些限制。 过去十年，基因组编辑领域从一个新兴的科学追求转变为一种变革性的生物技术力量。第一代CRISPR技术主要基于内源性修复或位点特异性DNA双链断裂（DSB），已被第二代技术，例如碱基编辑和先导编辑所补充，这些技术可以在不产生DSB的情况下直接靶向DNA修饰，通常被认为更安全，并产生更可预测的编辑结果。新兴第三代CRISPR技术正在开发中，以解决该领域中两个主要未满足的需求：实现大片段DNA序列的精确插入，以及通过表观基因组工程实现在没有任何基因组编辑的情况下进行基因调控。这些和其他技术的持续进步是由两种方法实现的：一方面，通过挖掘宏基因组来发现新的分子系统，另一方面，通过合成生物学和人工智能支持的分子工程。 基因组编辑的现状最好地体现在不断扩展的新技术和方法的组合中，这些技术和方法主要基于源自CRISPR-Cas系统的RNA引导分子工具，彻底改变了我们精确和轻松地操纵遗传物质的能力。当前的发展趋势表明，这些技术将继续得到改进，在特异性、效率和传递机制方面逐步提高。值得进一步研究的领域将包括开发更具特异性和免疫原性的递送载体、减少脱靶效应以及增强对编辑结果的控制，从而提高基因组编辑的准确性和精度。展望未来，与纯粹基于蛋白质的技术相比，核酸引导系统可能仍然是基因组编辑的核心，因为它们具有简单的可编程性和适应性。然而，它们的应用模式可能会演变，可能会转向更瞬时性的编辑方法，以最小化意外长期基因变化的风险，或者通过瞬时递送来最小化基因组的破坏和免疫反应。 随着第一代CRISPR技术已经通过体外编辑被批准用于临床治疗镰状细胞病（SCD）和β-地中海贫血等疾病，以及体内基因编辑疗法的出现，限制未来广泛的基因组导向的治疗发展的瓶颈将不再是缺乏安全、高效或精确的基因组编辑器。主要挑战将在于递送方法，特别是对于血液和肝脏以外的器官以及某些体外细胞类型。体内递送方法的进步，例如mRNA疫苗开发中所见，可能会显著促进CRISPR技术的应用。此外，即使是目前可用的CRISPR方法编辑的组织和细胞，也需要更多的基础研究来确定安全的编辑靶点。因此，随着新传递载体的开发以及致病变异及其纠正策略的表征，可以通过CRISPR治疗的疾病范围将不断扩大。预计CRISPR领域外的进展将有助于推动这些技术向新的方向发展，增强其功能。在这种背景下，人工智能（AI）的兴起将使我们能够准确地模拟复杂的基因组编辑场景，预测靶向和非靶向编辑结果，并设计更强大的基因组编辑器，从而加快实施安全治疗方法的步伐。 伦理和社会影响，特别是涉及人类生殖细胞基因组修改的问题，将继续成为基因组编辑讨论的前沿。随着人类体细胞编辑成为现实，治疗性和非治疗性生殖细胞编辑的前景，以及对人类基因组进行可遗传改变的潜力，提出了深刻的伦理问题，全球社会必须加以解决。由于人类胚胎的研究表明，CRISPR基因组编辑技术在用于生殖目的的生殖细胞编辑方面不够安全或有效。此外，生殖细胞编辑的治疗效用有限，可能只对少数人有益。然而，对于基因组编辑技术的治理和负责任的管理，国际共识的紧迫性不能被夸大，特别是考虑到其快速发展、不断改进和广泛采用。 总的来说，尽管存在这样那样的挑战，但CRISPR基因编辑的未来是光明的。它不仅有潜力推动研究突破和革命人类医学，还有潜力提高农业生产和应对气候生态挑战，从而为子孙后代建立一个更健康、更可持续的未来。
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